MENU

phương pháp MAS

Wait
  • Begin_button
  • Prev_button
  • Play_button
  • Stop_button
  • Next_button
  • End_button
  • 0 / 0
  • Loading_status
Nhấn vào đây để tải về
Báo tài liệu có sai sót
Nhắn tin cho tác giả
(Tài liệu chưa được thẩm định)
Nguồn:
Người gửi: Đỗ Thị Liên
Ngày gửi: 23h:16' 11-05-2012
Dung lượng: 2.6 MB
Số lượt tải: 71
Số lượt thích: 0 người

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG NÂNG CAO
Chuyên đề 5: Ứng dụng market phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn.

Nhóm thực hiện:
Trần Thị Phương Lan
Nguyễn Huy Lập
Đỗ Thị Liên
Trần Thị Lê Nga
Nguyễn Thị Ngọc
Phần I: Đặt vấn đề.
- Diện tích đất nông nghiệp trên thế giới cũng như Việt Nam ngày càng bị thu hẹp, trong khi đó dân số thì càng tăng cao. Làm áp lực đảm bảo an ninh lương thực của ngành nông nghiệp lớn.
Hướng giả quyết cần tạo ra các giống có năng suất cao, khả năng chống chụi các điều kiện ngoại cảnh tốt.
Chọn giống bằng phương pháp MAS là pháp chọn giống có ý nghĩa lớn trong nghành chọn tạo giống hiện nay và trong tương lai.
Do mực nước biển dâng làm cho diện tích đất nông nghiệp ngập mặn càng nhiều, từ thực trạng trên chúng tôi đi tìm hiểu “Ứng dụng phương pháp MAS trong xác định gen chịu mặn của các giống lúa địa phương”.
Phần II Nội Dung.
2.1 Cơ sở của MAS trong chọn giống.
2.1.1. Khái niệm chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử
- Chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection- MAS) là sử dụng chỉ thị DNA liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình.
2.1.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống bằng MAS
Ưu điểm.
- Độ tin cây cao.
- Chọn lọc sớm có thể chọn lọc ngay ở giai đoạn cây con có thể tiếp kiệm thời gian và nguồn lực, tiền bạc.
- Đặc biệt có ý nghĩa với tính trạng khó đánh giá thanh lọc.
- Cải tiến giống cây trồng nhanh và hiệu quả bởi vì nó không phụ thuộc vao giai đoạn sinh trưởng, không bị ảnh hưởng của môi trường
Nhược điểm.
Ở Việt Nam vẫn còn tồn tại những hiện trạng và thách thức như:
- Thiết bị không có sẵn
- Đánh dấu có thể không hiệu quả
- Độ chính xác của các nghiên cứu định vị QTL chưa cao.
- QTL hiệu ứng có thể phụ thuộc vào nền tảng di truyền hoặc bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường.
- Thiếu tính đa hình đánh dấu.
-Sử dụng phương pháp MAS là tốn kém hơn phương pháp truyền thống.

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN

1. Đặc điểm của đất mặn
Chứa hàm lượng muối cao (>0,2%), thành phần các muối trong đất mặn phổ biến là NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2, MgSO4  ... các muối đó ở nồng độ cao đều gây độc cho cây.
Có nhiều ion gây độc cho cây.
Có áp suất thẩm thấu của dung dịch đất cao (200-300atm hay còn có thể cao hơn).
Các ion này lại cạnh tranh với chất dinh dưỡng trong quá trình hút của rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dưỡng.
2. Tác hại của đất mặn đối với cây trồng
Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây rối loạn trao đổi chất của tế bào.
Các ion độc sẽ ức chế hoạt động các enzim, các chất kích thích sinh trưởng.
Làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm của chất nguyên sinh tăng mạnh. Tăng  mạnh  nhất  là tăng mạnh ngoại thẩm làm cho tế bào mất chất dinh dưỡng.
Gây rối loạn các hoạt động sinh lý của tế bào: quá trình quang hợp giảm mạnh, quá trình hô hấp tăng mạnh.
Nếu cây bị mặn nặng hay mặn kéo dài sẽ bị chết.


4. Các gen chịu mặn trên cây lúa
Qua nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều QTLs (Quantitative Trait Loci) ở lúa đã được nhận biết cho chịu mặn chủ yếu nằm ở nhiễm sắc thể số 1.
Có một số gen chính liên quan đến khả năng chịu mặn như:
- Một gen trong số đó là saltol.
- QNa với hút Na.
- QTL quyết định tính trạng hút Na+, nồng độ K+ và tỷ lệ  Na /K ratio, SKC1 hoặc OsHKT8, RNTQ1, SDS1.
- Vận chuyển Na+ và Cl- trong thân lúa và qST1.
4. Các gen chịu mặn
Cũng có những nghiên cứu xác định một số lớn QTL trên các nhiễm sắc thể khác như:
NST số 3, 4, 10 và 12 (Glenn, 1997).
NST số 4, 6 và 9 (Flowers et al, 2000).
NST số 4, 6 và 9 (Koyama et al, 2001).
NST số  4, 6, 7 và 9 (Lin et al, 2004).
NST số 2, 3, 8, và 9 (Ammar, 2004).
NST số 3 (Lee et al, 2006).
NST số 8 và 10 (Islam et al, 2006).
5. Các bước tiến hành chọn lọc giống chịu mặn
5.1. Tách chiết ADN từ các giống/dòng lúa nghiên cứu
Từ 15 giống lúa thu thập được, đã tiến hành tách chiết ADN và tách được 7 mẫu của các giống (nước mặn, ngoi tía, ven đỏ, chành trụi, lúa ngoi, nếp cúc, Pokkali).
Các mẫu ADN được điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 45 phút.
Các mẫu ADN tách chiết được có phẩm chất tốt như: nồng độ (200-350ng/µl), độ tinh sạch và nguyên vẹn cao.
Qui trình tách chiết
Lấy khoảng 1-2g lá mạ (2 tuần tuổi) nghiền với nitơ lỏng trong ống eppendorf thành dạng bột mịn.
Thêm 1ml dịch chiết (Extract buffer) (0,1M Tris-Cl, pH8; 0,05M EDTA; 0,5M NaCl; 0,01M β-mercaptoethanol) và 50µl 10% SDS. Ủ 30 phút ở 65oC, lắc nhẹ.
Ly tâm với tốc độ 12000v/p trong 20phút.Thu lấy dịch nổi ở bên trên cho vào ống eppendorf mới và thêm vào đó một thể tích tương ứng isopropanol. Lắc nhẹ. Ủ trong tủ đá 10-30 phút.
Ly tâm với tốc độ 12000v/p trong 10 phút. Bỏ pha nước, thêm vào 400µl TE để hoà tan kết tủa ADN.
Qui trình tách chiết
5. Thêm 1µl Rnase (10mg/µl)vào mỗi ống mẫu. Trước khi dùng đun sôi Rnase trong 5 phút hoặc ủ trước 65oC trong vòng 15 phút, sau đó mới tiến hành các thao tác tiếp theo.
6. Ủ mẫu ở 37oC trong 2h.
7. Thêm 400µl đệm CTAB (0,2M Tris-Cl, pH7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2%(w/v) CTAB, 0,1% Polyvinylpyrolidone). Ủ ở 65oC trong 15 phút. Trong khi ủ thỉnh thoảng lắc nhẹ.
8. Thêm 800µl Chloroform/isoamyl alcohol tỷ lệ 24/1 và lắc đều thành dạng sữa.

Qui trình tách chiết
9. Tiếp tục ly tâm với tốc độ 12000v/p trong 5phút. Chuyển phần dịch trong phía trên sang ống eppendorf mới, thêm 1,4ml ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
10. Ly tâm với tốc độ 12000v/p trong 10 phút, loại phần dịch và thêm vào 400µl ethanol 70%.
11. Ly tâm với tốc độ 12000v/p trong 5 phút, loại bỏ ethanol, cho vào máy quay khô.
12. Hoà tan ADN trong 200µl H2O (hoặc TE). Bảo quản ở nhiệt độ -20oC để dùng dần.
5.2. Phản ứng nhân bản ADN
Mồi SSR đã được sử dụng để tiến hành nhận ADN của các mẫu ADN đã tách chiết. 6 mẫu ADN đã được nhận dạng bằng 6 mồi SSR theo qui trình phản ứng PCR.
Bảng 1. Thành phần các chất dùng trong phản ứng PCR với mồi SSR
Bảng 2. Các bước phản ứng trong máy PCR
Bảng 3: Danh sách mồi sử dụng để nhận dạng ADN
Bảng 4. Thông tin về các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
5.2. Phản ứng nhân bản ADN
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel Polyacrylamid 12%, trong đệm TEA 1X, thời gian diện di 90phút.
Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các marker RM140, RM493, RM10745, RM1287, RM3412, RM8094 liên kết chặt với QTL chịu mặn Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 đều cho sản phẩm PCR trên các giống lúa nghiên cứu trừ giống Ngoi tía không có sản phẩm PCR.
5.2. Phản ứng nhân bản ADN
Pokkali là giống lúa đã được xác định là có đoạn gen chịu mặn QTL Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 10.8-12.28 Mb. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành so sánh kích thước các băng sản phẩm PCR nhận được của các giống lúa với băng sản phẩm PCR tương ứng của Pokkali nhằm xác định sự có mặt của gen chịu mặn trên các giống lúa nghiên cứu .
Từ việc nhận biết, phân tích các băng ADN xuất hiện trên ảnh điện di sản phẩm PCR, chúng tôi đã thống kê được sự xuất hiện của các băng ADN tương ứng với các đoạn ADN của QTL chịu mặn Saltol ở các giống lúa nghiên cứu.
Bảng 5. Sản phẩm PCR của 7 giống lúa với mồi SSR định vị gen chịu mặn QTL Saltol trên nhiễm sắc thể số 1, so sánh với Pokkali
Phần III. Kết luận & đề nghị
3.1. Kết luận.
Kết quả phân tích với 6 marker SSR cho thấy 6/7 giống lúa đều cho một hay nhiều băng ADN tương ứng với băng ADN của Pokkali (giống chuẩn kháng mặn).
Từ kết quả thống kê nhận thấy marker RM 140 cho băng đặc hiệu 261 bp nhiều nhất với 4 giống và marker RM 493 cho băng đặc hiệu 211bp với 1 giống, các giống lúa này đều là những giống có khả năng chống chịu mặn tốt theo thực nghiệm.
Nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết chặt với các QTL chịu mặn, cùng với những thí nghiệm thanh lọc mặn trên thực nghiệm, sơ bộ kết luận giống lúa mang gen chịu mặn trong nghiên cứu là các giống nước mặn, ven đỏ, chành trụi, lúa ngoi, nếp Cúc có mang gen chịu mặn trên nhiễm sắc thể số 1.
3.2 Đề nghị.
Tiếp tục làm thí nghiệm để xác định chính xác hơn gen chịu mặn của các giống lúa địa phương.
Tiếp tục nghiên cứu xác định các gen liên kết chặt với lôcus chụi mặn.
Sử dụng các gen chụi mặn này để ứng dụng vào trong công tác tạo giống lúa vừa có năng suất cao phẩm chất tốt vừa có khả năng chụi mặn tốt.




Xin chân thành cảm ơn thầy và các bạn đã lắng nghe nhóm 5 trình bày.
 
Gửi ý kiến